随着纳米科学与材料化学的快速发展，超分子纳米笼凭借其独特的限域效应、出色的分子识别能力和高选择催化活性，在催化领域的应用研究中受到了广泛关注[1-2]。超分子纳米笼的纳米结构为催化反应提供了一个理想的微环境，在提升反应效率、产物选择性和催化剂稳定性方面表现出显著的优势[3-5]。

蛋白纳米笼，特别是病毒样颗粒（VLPs）是一种天然存在的限域结构，相较于一些化学合成的限域体系，如沸石分子筛[6-8]、碳纳米材料[9-12]、金属有机框架材料[13-15]等，具有单分散和高度有序的结构特征及分布广泛、种类丰富、可再生的优势。以豇豆褪绿斑驳病毒（CCMV）衣壳蛋白（CP）自主装配形成的蛋白纳米笼呈现出二十面体对称结构〔三角形剖分数（T）=3〕，外径约28 nm，内部空腔直径约18 nm，由180个相同的CP亚单位组装而成（图1）[16-17]。此类VLPs在生物催化及药物传输等领域展现出重要的应用前景。近年来，研究人员利用VLPs封装不同种类催化剂，包括金属颗粒、酶类及有机金属小分子等，构建限域催化体系，并开展了多项催化反应研究[18-24]。朱劼等[23]制备了天然CCMV蛋白纳米笼封装Ru纳米催化剂（Ru@CCMV），并将其应用于肉桂醛加氢模型反应，其表现出较高的催化活性。天然蛋白纳米笼的自组装过程尽管具备诸多独特优势，然而，环境因素（pH、离子强度和静电作用等）往往会显著影响其自组装过程中蛋白的稳定性和自组装行为，进而影响蛋白纳米笼的形成和催化性能。具体而言，CCMV衣壳在pH=3～6，且离子强度约为0.1 mol/L的条件下，能够保持稳定存在；然而，pH上升至7.5，同时离子强度增至1.0 mol/L时，衣壳将解离为蛋白二聚体[25-26]，即其笼形结构遭到破坏。因此，如何开发一种能在不同环境条件下保持相对稳定的自组装蛋白纳米笼体系，对于提升其在催化领域的应用价值具有重要意义。

图1 CCMV衣壳形貌[16-17]
Fig. 1 CCMV capsid morphology[16-17]

弹性蛋白样多肽（ELP）是一种对温度敏感的多肽，其结构是由9个重复的缬氨酸-脯氨酸-甘氨酸-X-甘氨酸（Val-Pro-Gly-X-Gly）（VPGXP）五肽单元构成，其中，X代表除脯氨酸外的任意一种天然氨基酸[27-28]。天然ELP序列为：VPGVG-VPGLGVPGVG-VPGLG-VPGVG-VPGLG-VPGGG-VPGVGVPGLG，以通用符号ELP[V4L4G1-9]来描述，下标数字（4、4、1）为客体残基的比例，9为五肽重复序列的数量[29-31]。ELP分子结构富含疏水基团及弹性结构域，能够根据温度或盐含量的变化，在亲水性与疏水性之间实现可逆转换[27]。通过将ELP与病毒CP共表达，可实现热响应自组装。这一方法有效解决了天然蛋白纳米笼稳定性不足的问题。通过调控温度，可以实现对蛋白纳米笼自组装过程的精细控制，避免了传统自组装方法中对于pH、离子强度等多种环境因素的严格依赖。在特定温度范围内，仅需简单调整温度，即可实现蛋白纳米笼的自组装与解组装，操作简便快捷，有利于实现大规模制备与应用；此外，热响应自组装所形成的蛋白纳米笼结构展现出高度的稳定性和良好的重复性，为后续催化剂的封装及催化性能研究奠定了坚实的基础。

本文拟采用大肠杆菌（E. coli）BL21共表达一种对多重环境因素具有响应性的ELP-CCMV CP融合蛋白，并对天然ELP进行改造，将其结构域第1和第8两个五肽中的客体缬氨酸（V）突变为色氨酸（W），获得一种更具疏水性的ELP，以进一步提升蛋白笼的稳定性，将其封装Pt纳米颗粒，制备一种蛋白笼结构限域的Pt纳米催化剂。然后，以4-硝基苯酚（4-NP）的催化还原反应为模型，对蛋白笼结构限域的Pt纳米催化剂的催化活性进行评价。以期为生物纳米材料和仿生催化等前沿领域中VLPs的规模化生产提供一种简便且环境友好的技术方案，并为此领域的技术创新和应用开辟新的潜力。

1 实验部分

1.1 材料、试剂与仪器

原核表达载体pET28(+)、大肠杆菌BL21(DE3)，上海天霖生物科技有限公司；蛋白Marker、PCR扩增试剂盒，上海捷瑞生物工程有限公司。

卡那霉素、三羟甲基氨基甲烷（Tris），青岛生工生物科技有限公司；Future PAGE蛋白预制胶、Running Buffer，常州伯仪生物科技有限公司；胰蛋白胨、酵母提取物，英国OXOID公司；T4 DNA连接酶、限制性内切酶（NcoI、BamHI）、Tango Buffer（10X），美国Thermo Fisher Scientific公司；NaCl、MgCl2、咪唑、NaBH4、异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG），AR，上海阿拉丁生化科技股份有限公司；4-NP、柠檬酸钠、冰醋酸、无水乙醇、二硫苏糖醇（DTT）、乙酸钠（NaAc），AR，上海麦克林生化科技有限公司；氯铂酸水合物，AR，天津希恩思生化科技有限公司；Ni-NTA Beads 6FF，常州天地人和生物科技有限公司。

JEM-2010型透射电子显微镜（TEM），日本电子株式会社；NANO-ZS-ZEN 3600型纳米粒度分析仪，英国马尔文仪器有限公司；Avio 550 MAX型电感耦合等离子体发射光谱仪（ICP-OES）、DSC 8500型差示扫描量热仪（DSC），美国Perkin Elmer仪器有限公司；BMG POLARstar Omega全波长多功能酶标仪，德国BMG Labtech公司；Tanon 1600型凝胶成像系统，上海天能科技有限公司；PHI 5000 VersaProbeⅢ型X射线光电子能谱仪（XPS），日本ULVAC-PHI公司。

1.2 方法

1.2.1 菌株及其培养

LB培养基配制：LB液体培养基（均为质量浓度，g/L）：蛋白胨10、酵母浸粉5.0、NaCl 10，pH=7.0，121 ℃灭菌20 min。LB固体培养基灭菌前添加质量浓度为15 g/L的琼脂。灭菌后，培养基冷却至50 ℃再添加终浓度为50 mg/L的硫酸卡那霉素。培养温度37 ℃，摇床转速200 r/min。

重组菌株在LB培养基中培养，卡那霉素使用时终质量浓度为25 mg/L。

1.2.2 重组质粒的制备

以实验室保存的天然CCMV序列为原始模板，利用ELP序列替代CCMV的N末端阳离子核酸结合结构域（ARD），并在ELP序列前端添加His标签，构建Native ELP-(Δ26)CCMV CP（NCP）。之后，将ELP的第1个和第8个客体残基处的缬氨酸突变为色氨酸，构建VW1-VW8 ELP-(Δ26)CCMV CP（VCP）（上海天霖生物科技有限公司），如图2所示。PCR扩增体系为DNA模板1.0 μL、引物混合物2.0 μL、超纯水7.0 μL、RT-qPCR酶为10.0 μL。PCR扩增条件为96 ℃预变性5 min，96 ℃变性30 s，59 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，24个循环，最后72 ℃延伸10 min。

图2 CCMV和ELP-CCMV蛋白结构图
Fig. 2 Protein structures of CCMV and ELP-CCMV

Native ELP-CP的正向引物是5-CATGCCATG GGACATCACCATCATCATC-3（CCATGG），反向引物是5-CGCGGATCCTTAATACACCGGAGTG AAAGAG-3（GGATCC）。VW1-VW8 ELP-CCP的正向引物是5-CATGCCATGGGTCACCATCACCA TCAC-3（CCATGG），反向引物是5-CGCGG ATCCT TAA TACACCGGAGTGAAAAGAG-3（GGATCC）。

T4 DNA连接酶连接CCMV CP目的基因片段和载体pET28a(+)，得到重组质粒pET28a(+)- NCP和pET28a(+)-VCP。用NcoI和BamHI内切酶进行双酶切回收CCMV CP目的片段及载体pET28a(+)。通过质量分数为1%的琼脂糖凝胶电泳对重组质粒进行双酶切验证。双酶切体系为NcoI（1 µL）、BamHI（1 µL）、Plasmid（5 µL）、10×Buffer Tango（8 µL）、超纯水（5 µL）。

1.2.3 基因工程菌的制备

将10 μL重组质粒加入到100 μL大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中，冰上静置30 min，在42 ℃下热激90 s后，立即置于冰上静置1 min，LB液体培养基补足至1 mL，混匀后在37 ℃、150 r/min振荡条件下培养复苏1 h，低速离心后将剩余培养基涂布于含卡那霉素的LB培养基平板上，在37 ℃下培养过夜。构建的菌株分别记为重组菌株NCP和重组菌株VCP。

1.2.4 目标蛋白的纯化

复苏菌种，在37 ℃下过夜培养活化。接种量为1%（体积分数），接入扩大培养基中，在37 ℃下培养至吸光度0.4时，加入浓度0.1 mol/L的IPTG，24 ℃诱导过夜。结束发酵后，在4 ℃、10000 r/min下离心10 min，收集菌体。加入溶菌酶进行超声破碎（冰浴，功率300 W，运行1 s，间隙2 s，20 min）。裂解后，在4 ℃、12000 r/min下离心20 min，收集上清，使用0.45 μm滤头过滤，得到CCMV CP粗蛋白溶液。

将过滤后的上清与平衡后的Ni-NTA琼脂糖树脂填料充分结合，依次向吸附柱中加入浓度50、500 mmol/L的咪唑缓冲液，收集洗脱液。使用超滤离心管浓缩CCMV CP粗蛋白溶液，收集超滤管中浓缩液体，即为CCMV CP蛋白纯化液，置于4 ℃保存备用。

1.2.5 融合蛋白封装Pt纳米催化剂的制备

采用原位还原法制备NCP和VCP封装Pt纳米催化剂。将1.000 mL浓度0.165 mmol/L组装状态下的NCP和VCP VLPs与0.420 mL浓度6 mmol/L的氯铂酸水溶液充分混匀，室温下搅拌30 min，再向溶液中加入0.126 mL浓度0.1 mol/L的NaBH4溶液，匀速搅拌25 min，搅拌结束后，将反应液置于截留相对分子质量3 kDa的透析袋中，使用组装缓冲液（由浓度0.1 mol/L NaAc、0.3 mol/L NaCl、0.01 mol/L MgCl2组成，pH=4.8）透析过夜。最后，得到NCP和VCP封装Pt纳米催化剂，分别记为Pt@NCP和Pt@VCP。

1.2.6 柠檬酸稳定的Pt纳米催化剂的制备

将1.000 mL质量分数1%的柠檬酸钠和0.420 mL浓度6 mmol/L的氯铂酸水溶液充分混匀，常温下800 r/min匀速搅拌30 min。之后，加入0.126 mL浓度0.1 mol/L的NaBH4水溶液，继续搅拌25 min。最后得到柠檬酸稳定的Pt纳米催化剂胶体溶液，记为Pt-CA。

1.3 表征方法与性能测试

TEM测试：取部分样品分散到无水乙醇中进行超声，取几滴分散好的液体逐滴滴加到铜网上，经过晾干后，加速电压100 kV，选中位置逐级放大拍摄。XPS测试：Al Kα为射线源，并以C 1s（284.8 eV）为基准对数据进行校正。ICP-OES测试：向150 µL Pt催化剂水分散液中加1 mL王水，在90 ℃下加热至蒸干，超纯水定容至10 mL，稀释一定倍数后进行测试。

1.4 融合CP自组装因素实验

1.4.1 pH对融合蛋白体外自组装的影响

将纯化后的蛋白壳装入透析袋中，在分解缓冲液（0.02 mol/L Tris-HCl、0.3 mol/L NaCl、0.001 mol/L DTT、0.01 mol/L MgCl2，pH=7.4）中，在25 ℃下透析24 h。将分解后的蛋白壳在重组缓冲液（浓度0.1 mol/L NaAc、0.3 mol/L NaCl、0.01 mol/L MgCl2，pH=4.8）中透析，在25 ℃下透析24 h。

1.4.2 盐浓度对融合蛋白体外自组装的影响

考察pH=4.8和7.4时，NaCl浓度对VLPs的影响。在两个pH下，使用14 kDa透析袋分别将质量浓度0.5 g/L的NCP和VCP融合蛋白浸入分解缓冲液中，在25 ℃下透析24 h。分解完全后，NCP和VCP溶液分别置于浓度0～0.9和0～2.4 mol/L的NaCl组装缓冲液中透析24 h。

1.4.3 温度对融合蛋白体外自组装的影响

将质量浓度0.5 g/L的CCMV CP装入到14 kDa透析袋中，在分解缓冲液中4 ℃透析24 h。采用DCS测试4～40 ℃的NCP和VCP自组装相变温度。

1.5 蛋白笼封装Pt纳米催化剂性能的测试

以4-NP催化加氢还原生成4-氨基苯酚（4-AP）为模型反应，评价蛋白笼封装Pt纳米催化剂的催化性能，以Pt-CA作为对照。4-NP加氢反应路线如下所示。

向200 µL反应管中加入126 µL超纯水、30 µL 4-NP（浓度1 mmol/L）和20 µL蛋白笼封装Pt纳米催化剂（Pt浓度5.12 μmol/L），混合均匀后加入24 µL NaBH4（浓度16 mmol/L），开始反应计时。使用酶标仪在250～500 nm处进行全波段扫描，反应总时间20 min。在25 ℃下，考察不同催化剂Pt@VCP、Pt-CA及其在不同反应温度（25、30、35、40 ℃）下对反应速率常数的影响，并计算催化反应的活化能。

4-NP、4-HP和4-AP分别在波长320、400和296 nm处具有最大吸光度。由于4-NP催化还原至中间产物4-HP的过程极短。因此，为简化计算，4-NP转化率（